Фамилия Мафусаилов — один из ярких примеров того, как в русской ономастике приживались библейские имена, причём не из частотного календарного списка, а из разряда редких, почти экзотических. Основа фамилии — имя Мафусаил (в русской традиции часто Мафусал), которое носил один из ветхозаветных патриархов, знаменитый своим долголетием: по Библии, он прожил 969 лет. В народном сознании имя стало нарицательным — «мафусаилов век» означал очень долгую жизнь.

Образование фамилии идёт по классической восточнославянской модели: к основе Мафусаил- добавился притяжательный суффикс -ов, указывающий на принадлежность. В буквальном смысле Мафусаилов — это «сын (или потомок) Мафусаила». Суффикс -ов, а не -ин, говорит о том, что имя отца оканчивалось на твёрдый согласный (в имени Мафусаил конечный -л). Если бы в основе было имя Мафусаила, фамилия звучала бы как Мафусаилин, но такого варианта практически не встречается.

Главная особенность фамилии — её редкость. В отличие от распространённых Ивановых или Петровых, Мафусаиловы никогда не были массовыми. Это объясняется тем, что имя Мафусаил не входило в число частых крестильных имён на Руси. Его могли дать в монашестве или в очень набожных семьях, желавших подчеркнуть связь с древней библейской историей. Встречаются единичные случаи бытования фамилии в южнорусских и украинских регионах, где влияние старообрядческих и сектантских традиций было сильнее, и неканонические или редкие библейские имена давали чаще.

С точки зрения социального контекста, носитель такой фамилии в XIX веке почти наверняка был выходцем из духовного сословия или из среды грамотных крестьян, близких к церкви. Фамилии, образованные от библейских имён без уменьшительных суффиксов (вроде Самсонов, Ааронов, Соломонов), были характерны для семинаристов и священников, которым при поступлении в училище нередко меняли «мирскую» фамилию на более благозвучную или книжную. Однако Мафусаилов могла возникнуть и естественным путём — как отчество от отца, которого в деревне прозвали Мафусаилом за долгожительство или просто по имени, данному при крещении.

В современном русском языке фамилия звучит архаично и несёт отпечаток библейской торжественности. Она не даёт точных указаний на место происхождения, но однозначно свидетельствует о том, что предок носителя был человеком, чьё имя выбивалось из обыденного ряда — либо по воле родителей, либо по решению церковных властей.