Фамилия Мачушенко образована по типичной для украинских и белорусских земель модели с суффиксом -енко, который в XVI–XVII веках означал «сын» или «потомок». Поэтому первое и прямое значение фамилии — «сын Мачуша» или «потомок Мачуша». Основа Мачуш — это, скорее всего, уменьшительно-ласкательная форма от какого-либо имени или прозвища.

Здесь и начинается главный интерес. В украинской ономастике существует несколько равновероятных версий происхождения основы. Первая и самая очевидная: Мачуш — это производное от крестильного имени Матфей (в народной украинской форме Матвій, отсюда уменьшительные Матюша, Матюш, Мачуш). Вторая версия отсылает к прозвищу от слова «мати» (мать). «Мачуха» — мачеха, а «мачуш» в некоторых говорах могли называть того, кто жил при матери, маменькиного сынка, либо, наоборот, человека, которого воспитывала мачеха. Третья, более редкая версия, связывает фамилию с диалектным глаголом «мачушити» — бить, колотить. В этом случае прозвище Мачуш мог получить драчун или, напротив, человек, которого часто били.

Словообразовательный суффикс -енко чётко указывает на украинское происхождение фамилии. В России такие фамилии массово появлялись при переселении малороссов на новые земли, особенно в XVIII–XIX веках в ходе заселения Слобожанщины, Кубани и юга России. Социальный состав носителей был преимущественно крестьянским или казачьим — фамилии на -енко редко встречались среди дворянства, которое предпочитало модели на -ов/-ев или -ский.

Сравнение с однокоренными фамилиями помогает уточнить ареал. Мачуха, Мачулин, Мачульский — все они тяготеют к западу и центру Украины. Мачушенко, с его уменьшительной основой, мог возникнуть на Полтавщине или Черниговщине, где любили ласкательные формы имён и прозвищ. Написание фамилии устойчиво: вариант Мачушенко встречается чаще, чем Мачушенок или Мачушенков, которые могли бы появиться при русификации.

Известных исторических личностей с такой фамилией в открытых источниках не зафиксировано, что типично для фамилии, не принадлежавшей к дворянским родам. Фамилия осталась в народной среде и не попала в гербовники или биографические справочники XIX века.