Фамилия Настюченко — характерный пример украинской модели фамилий на -енко, которая в XVII–XVIII веках распространилась по всей Левобережной и Слободской Украине, а затем и на юг России. Суффикс -енко в этой традиции означал «маленький», «сын» или «потомок»: Настюченко — буквально «сын Настюка» или «потомок Насти».

Основа фамилии — имя Настя, сокращённая форма канонического женского имени Анастасия. В древнерусской и украинской среде женские имена в качестве основы для фамилии встречаются реже мужских, но не являются исключением. Чаще всего так образовывали прозвище или отчество по матери — в случае, если мать была вдовой, главой семьи или просто пользовалась большим авторитетом в округе. Например, в казацких реестрах XVII века встречаются фамилии вроде Марущенко (от Маруся) или Ганнущенко (от Ганна). Настюченко — из того же ряда.

Менее вероятная, но возможная версия — происхождение от прозвища Настюк, которое могли дать человеку, связанному с праздником Святой Анастасии (отмечается 4 января по старому стилю), или же просто ласково называвшему кого-то «настёна», «настюха». В этом случае Настюк — уже мужское прозвище, а Настюченко — его «сын». Но поскольку суффикс -юк в украинских фамилиях чаще образует отчества от мужских имён (Иванюк, Павлюк), вариант с женским именем выглядит более правдоподобным.

Географически фамилия Настюченко тяготеет к центральным и восточным областям Украины — Черкасской, Полтавской, Сумской, а также к югу России, куда в XVIII–XIX веках переселялись украинские крестьяне и казаки. В документах XIX века носители фамилии встречаются среди государственных крестьян и мещан, то есть сословной элиты за ней не закрепилось. С точки зрения словообразования, фамилия не перегружена редкими элементами, но именно её «материнская» основа отличает её от более массовых Настенко или Настасенко — те образованы уже от полной формы имени Анастасия.