Фамилия Мацалышенко — яркий пример украинской модели фамилий на -енко, самой распространённой на Левобережной и Степной Украине. Суффикс -енко в XVII–XVIII веках буквально означал «маленький» или «сын такого-то», но со временем закрепился как родовой, семейный знак, утратив уменьшительный оттенок. В основе фамилии лежит прозвище или имя Мацалыш, которое само по себе требует разбора.

Корень «мацал-» почти наверняка связан с украинским глаголом «мацати» — щупать, трогать, ощупывать. В диалектах слово «мацало» могло означать либо человека, который всё трогает руками (суетливого, неусидчивого), либо, что вероятнее, слепца или подслеповатого — того, кто вынужден ориентироваться на ощупь. Прозвища от «мацати» встречаются в украинской антропонимии: Мацало, Мацань, Мацай. Форма Мацалыш — это уже производное с суффиксом -ыш, который в восточнославянских языках часто давал именования по характерному признаку (ср. Глупыш, Малыш, Крепыш). Таким образом, Мацалыш — человек, которого прозвали за привычку или необходимость всё щупать.

Дальнейшее присоединение суффикса -енко дало фамилию Мацалышенко, то есть «сын Мацалыша». Такая трёхступенчатая модель (корень → прозвище на -ыш → фамилия на -енко) встречается реже, чем простые варианты вроде Мацаленко, и указывает на то, что прозвище Мацалыш успело закрепиться как устойчивое семейное или индивидуальное имя до того, как стало основой для фамилии.

Географически фамилия тяготеет к центральным и восточным областям Украины, особенно к Черкасской, Полтавской и Киевской. В России она встречается спорадически, чаще всего в Краснодарском крае и Ростовской области — регионах массового переселения украинских крестьян в XIX–XX веках. Сословной принадлежности у фамилии нет: её могли носить как казаки, так и крестьяне или мещане, поскольку прозвищная основа не указывает на ремесло или социальный статус.

В написании фамилии возможна вариативность: Мацалышенко, реже Мацалишенко (через «и»), что связано с неустойчивостью безударных гласных в украинских говорах. Однако корень «мацал-» с буквой «а» — основной и этимологически верный. Фамилия не имеет отношения к польским или еврейским корням, хотя на слух может казаться необычной для русского уха.