Фамилия Настюхин образована от имени Настюха. Это не официальная, а разговорная или уменьшительно-ласкательная форма женского имени Анастасия. В русской деревне XIX века такое прозвище — Настюха — давали девушке или женщине по имени Анастасия, и именно от этого бытового варианта, а не от полного церковного имени, пошла фамилия.

Суффикс -ин указывает на модель образования, типичную для русских фамилий второй половины XVI–XVII веков. Он означает принадлежность: «чей сын?» — Настюхин, то есть сын Настюхи. В отличие от фамилий на -ов/-ев, которые чаще образовывались от мужских имён или прозвищ, -ин активно использовался и от женских основ, особенно если глава семьи был известен по матери или жене. Такое случалось, когда мать оставалась вдовой с детьми или была более заметной фигурой в общине.

С точки зрения словообразования фамилия редкая. От имени Анастасия существует масса фамилий: Настасьин, Настенкин, Настин, Насточкин. Вариант Настюхин стоит в ряду с Настюшкиным и Настюшиным — он образован от суффиксальной формы -юх(а), которая в русских говорах придаёт имени оттенок фамильярности или простонародности. В ономастике это указывает на то, что предок носителя фамилии жил в среде, где ценились не официальные, а свои, «домашние» прозвания.

Географически фамилия Настюхин встречается преимущественно в центральных и южных регионах России — в Воронежской, Липецкой, Ростовской областях. Встречается она нечасто, что говорит о локальном происхождении: скорее всего, родоначальник был крестьянином или однодворцем из одного конкретного села, и фамилия не получила широкого распространения за его пределами.

Спорных версий происхождения у фамилии практически нет. Корень очевиден, и связь с именем Анастасия не вызывает сомнений. Иногда пытаются вывести Настюхина от прозвища Настёха (от слова «наст» — ледяная корка на снегу), но это натяжка: форма Настюха не имеет к слову «наст» никакого отношения, а в русских говорах слово «настёха» не фиксируется как прозвище. Поэтому единственная правдоподобная версия — от имени.