Фамилия Молофей — редкая, и её происхождение не лежит на поверхности. В отличие от большинства русских фамилий, она не оканчивается на суффикс принадлежности (-ов, -ин, -ский). Молофей — это, скорее всего, застывшая форма прозвища или имени, которое не подверглось дальнейшей русификации.

Самая вероятная версия связывает фамилию с украинским или южнорусским диалектным словом «молофей» — так в некоторых областях называли нерасторопного, медлительного или простоватого человека, иногда с оттенком «разиня». В этом случае прозвище давалось по характеру, и человек, получивший его, стал родоначальником Молофеев (в форме без суффикса, что встречается у украинских и белорусских фамилий, а также у тех, кто попал в списки казаков). Встречается и вариант с ударением на последний слог — Молофей, что характерно для украинской ономастики.

Менее распространённая, но не исключённая версия — происхождение от крестильного имени. В святцах есть имя Малафей (от греческого «малакия» — мягкость, нежность), которое в народной речи могло преобразоваться в Молофей. Подобные фонетические изменения (аканье, замена гласных) типичны для живой речи: Малафей — Молофей. Если это так, то фамилия ведёт род от человека, носившего это редкое церковное имя.

Географически фамилия Молофей тяготеет к юго-западу России и Украине. В дореволюционных записях она встречается в Курской, Харьковской губерниях, а также среди запорожских и кубанских казаков. В современной России носители фамилии рассеяны, но сохраняют плотность в тех же регионах. Интересно, что форма без суффикса — Молофей, а не Молофеев — говорит о том, что фамилия могла закрепиться в среде, где не было обязательной патронимической приставки, например, среди однодворцев или казаков, которые часто записывались просто по прозвищу.