Фамилия Настюнин образована от имени или прозвища Настюня — уменьшительно-ласкательной формы женского имени Анастасия. В русской ономастике это редкий случай, когда фамилия происходит от женского имени, а не от мужского. Обычно фамилии на -ин образуются от основ, оканчивающихся на -а/-я, и указывают на принадлежность: Настюня — дочь или жена Насти, то есть «чей-то человек». Но здесь не всё так однозначно.

Скорее всего, прозвище Настюня дали мужчине — либо по имени матери (вдове, которая одна воспитывала сына, его могли называть «Настюниным» — сыном Насти), либо по характеру: так в деревнях нередко дразнили излишне мягкого, домовитого или женоподобного мужчину. Вторая версия правдоподобнее, потому что в русских говорах слово «настюня» могло означать «неженка», «маменькин сынок» или «плакса». В словаре В. И. Даля «настюня» — ласковое обращение к девочке, но в крестьянской среде прозвища часто давали с иронией: если парень был тихим и домашним, его и звали «девчачьим» именем.

Суффикс -ин указывает на патронимическое происхождение: Настюня → Настюнин сын. Фамилия редкая, географически привязана к центральным и северным областям России (Вологодчина, Архангельская область, Костромская земля), где фамилии на -ин особенно распространены. В южных регионах, где преобладают фамилии на -ов/-ев, Настюнин почти не встречается.

Интересно, что фамилия не имеет однозначной мужской основы, как большинство русских фамилий. Если бы она образовалась от мужского имени Настён (редкая форма от Анастасий), то выглядела бы как Настёнов. Но Настюнин — это именно «от Настюни», то есть от женского корня. В старых переписных книгах такие фамилии могли фиксировать за «примаками» — мужчинами, которые после женитьбы жили в доме тёщи или матери жены, и их дети наследовали прозвище по материнской линии.

Сравните с однокоренными: Настин (прямо от Настя) — тоже редкая фамилия, Настюшкин — ещё более редкая, а Настюнин стоит особняком из-за суффикса -юн-, который в русских прозвищах встречается нечасто (ср. Хавронья — Хавронюня, но фамилии Хавроньюнин нет). Это добавляет фамилии уникальности: её носители — потомки, скорее всего, одного конкретного человека по прозвищу Настюня, жившего в северной или центральной части России не позднее XVII века.