Фамилия Мажухно — украинская по происхождению, с характерным южнорусским суффиксом -но. В украинской ономастике такие фамилии (на -о, -енко, -ук, -юк) часто указывают на принадлежность к определённой местности или роду, но суффикс -но здесь редкий и требует разбора.

Основа фамилии — «мажух» или «мажуха». Скорее всего, это прозвище от глагола «мазать» (украинское «мазати»). В народной речи «мажуха» могла означать человека, который пачкается, мажет что-то, либо того, кто занимается малярным делом или смазкой колёс, телег. В некоторых говорах так называли неуклюжего, неопрятного человека. Есть и менее очевидная версия: от слова «мазюка» — так в украинских диалектах называли рисунок, каракули, а «мажуха» — тот, кто рисует, малюет (возможно, иконописец или художник-самоучка).

Суффикс -но (вместо более распространённого -енко или -ук) указывает на то, что фамилия могла закрепиться в определённом регионе — на Полтавщине или Черниговщине, где такие формы встречаются чаще. В польской традиции суффикс -но тоже встречается, но для украинских фамилий он скорее исключение, чем правило. Фамилия не дворянская и не казачья старшина — скорее всего, крестьянская или мещанская, от прозвища по занятию или внешности.

По документам фамилия Мажухно встречается в переписях XIX века на территории современной Украины, особенно в Черниговской и Полтавской губерниях. В России она редкая, в основном у потомков переселенцев. Известных носителей с громкой историей нет, что типично для фамилий такого типа — они остались в тени, но сохранили бытовую, точную характеристику предка.