Фамилия Матухно звучит на южнорусский и украинский лад — характерный суффикс -но выдает в ней выходца с земель, где формировалась украинская и белорусская ономастика. Такие фамилии (Терехно, Левченко, Шинкаренко) образовывались от имени или прозвища отца с помощью патронимического суффикса, указывающего на принадлежность: «чей сын?» — Матухнин, то есть сын Матуха.

В основе фамилии лежит имя Матух — народная, разговорная форма от канонического церковного имени Матфей. В быту имя Матфей сокращали до Матя, Матуха, Матюха, и от такой уменьшительной формы и пошла фамилия. Вариант Матухно — это уже «сын Матуха», то есть Матухнович, но в украинской традиции суффикс -но заменил полное отчество, закрепившись как фамилия.

Менее вероятная, но возможная версия связывает фамилию с украинским словом «матуха» — так в некоторых говорах называли мать, матушку. Однако в этом случае фамилия скорее была бы прозвищем, данным человеку по характеру или семейной роли, но патронимическая модель с суффиксом -но убедительнее указывает на происхождение от мужского имени.

Фамилия распространена в основном в Украине, особенно в Черниговской, Сумской и Полтавской областях, а также среди потомков переселенцев на юге России и в Краснодарском крае. Встречается и в Беларуси, но реже. В документах XIX века носители фамилии Матухно числились преимущественно крестьянами и казаками, что типично для украинских фамилий такой модели — они не были дворянскими, а фиксировали сословную принадлежность к свободному сельскому населению.