Фамилия Трегубои — редкий случай, когда прозвище стало фамилией, почти не изменив своей формы. В ней нет привычных фамильных суффиксов (-ов, -ин, -ский), которые в русском языке превращают прозвище в фамилию («Трегуб» → «Трегубов»). Форма «Трегубои» — это застывшая форма множественного числа или родительного падежа, что характерно для восточноукраинских и южнорусских фамилий (сравните: «Кривых», «Черных», «Толстых»). По сути, носитель такой фамилии — это «из рода Трегубых» или «те, кто Трегубои».

Основа фамилии — прозвище «Трегуб». Оно составное: «тре-» (три) и «губ» (губа). В древнерусском языке «губа» могла означать не только часть лица, но и гриб (губка), залив, а в некоторых говорах — даже рот или пасть. Наиболее вероятное значение прозвища — «тот, у кого тройная губа», то есть человек с заметной особенностью строения рта: например, с рассечённой губой (заячья губа) или с толстой, отвислой нижней губой, которая казалась раздвоенной или утроенной. В народе такие приметы не скрывали — они становились уличными кличками, которые закреплялись за родом.

Менее распространённая версия отсылает к тому же корню «губ» в значении «губить», но тогда «трегуб» означало бы «трижды погубивший» или «троекратный губитель». Эта гипотеза слабая: прозвища с таким мрачным смыслом почти не встречаются в русской антропонимии, и нет оснований притягивать её без документальных подтверждений.

Географически фамилия Трегубои (и её вариант Трегуб) тяготеет к Курской, Белгородской, Воронежской областям и к Слобожанщине (северо-восток Украины). Это регион, где активно бытовали прозвищные фамилии без суффиксов. В переписных книгах XVII века встречаются крестьяне и казаки с прозвищем Трегуб, но в форме «Трегубои» фамилия фиксируется позже — в XIX веке, когда окончание закрепилось как родовой признак.

У фамилии есть однокоренные «родственники»: Трегубов (самая частая форма, образованная стандартным патронимическим суффиксом), Трегубенко (украинский вариант), Трегубович (белорусский). Но «Трегубои» стоит особняком — она сохранила исходное окончание, которое в других регионах давно отсекли или заменили. Поэтому носитель этой фамилии с высокой вероятностью происходит из семьи, где прозвище дали предку ещё в допетровскую эпоху, а фамилию не «причёсывали» под общий стандарт при переписях.