Фамилия Евстефеев образована от мужского крестильного имени Евстафий. В переводе с греческого языка оно означает «уравновешенный, крепкий, здоровый». В основу фамилии легла производная, народная форма этого имени — Евстефей. Такое стяжение (утрата звука «а» и упрощение группы «стф» до «ст») характерно для русской бытовой традиции: длинные и непривычные для слуха канонические имена часто сокращали и переделывали на свой лад. Так, полный Евстафий превращался в Евстей, Евстефей, а в некоторых говорах — в Остафий или Остап.

Фамилия строится по стандартной модели: к основе Евстефей прибавляется суффикс -ев, указывающий на принадлежность («чей?» — Евстефеев сын). Это одна из самых распространённых в русской ономастике словообразовательных схем. С точки зрения социального контекста, фамилия на -ев, скорее всего, сложилась в крестьянской или мещанской среде, где отчество постепенно закреплялось за целым родом.

Одним из небесных покровителей этого имени считается святой мученик Евстафий Мухетский, погибший в Тифлисе в 589 году. Его мощи покоятся в Соборе двенадцати апостолов в Мцхете. В народной памяти образ святого мог подкреплять популярность имени, хотя в повседневном обиходе имя Евстафий и его производные не были чрезвычайно распространены. Фамилия Евстефеев встречается реже однокоренных Евстафьев, Остафьев или Остапов — это говорит о том, что конкретный вариант Евстефей бытовал в ограниченных регионах, скорее всего, в центральных и южнорусских говорах, где любили «обкатывать» сложные церковные имена до более простых форм.