Фамилия Пустынина образована по одной из самых распространённых в русской ономастике моделей: от прозвища или мирского имени с помощью суффикса -ин. Этот суффикс указывает на принадлежность: Пустынина — «дочь (или жена) Пустыни», то есть человека по прозвищу Пустыня.

Основа фамилии — слово «пустыня». В древнерусском языке у него было два основных значения. Первое, прямое — безлюдное, пустынное место. Второе, церковное — уединённое жилище отшельника, скит. Прозвище Пустыня могли дать человеку, который жил в глухой, отдалённой местности, в лесу или степи, в стороне от селений. Но не менее вероятно, что прозвище относилось к монаху-отшельнику или к мирянину, который поселился близ монастыря, у «пустыни» — так в народе называли скиты и пустынные обители.

В русских говорах у слова «пустыня» были и переносные, бытовые значения. В некоторых регионах так называли захолустье, глухомань, а также нелюдимого, молчаливого человека, «пустынника» по характеру. В этом случае прозвище могло закрепиться за домоседом или за тем, кто сторонился людей.

Фамилия Пустынина — женская форма. Мужской вариант — Пустынин. Оба они встречаются в центральных и северных областях России, особенно в Вологодской, Архангельской, Костромской губерниях, где было много монастырских «пустыней» и где слово бытовало в крестьянской среде как прозвище.

У фамилии есть и редкая, спорная версия, связывающая её с названием растения «пустырник» или с диалектным глаголом «пустынить» (пустовать, быть без дела). Но она не подкреплена ни географией фамилии, ни словообразовательной логикой: суффикс -ин в русских фамилиях почти всегда присоединяется к личному прозвищу, а не к названию травы.

Таким образом, предки современных Пустыниных — скорее всего, люди, жившие в глухих местах, либо выходцы из монастырских слобод, либо носители бытового прозвища за нелюдимый или уединённый образ жизни.